Фибробласты и влияние на них препарата Meso–Wharton P199™: экспериментальные исследования

Услуги Врачи Результаты Отзывы

Проверено экспертом

Гуценко Лилия Анатольевна Врач-косметолог

Дата публикации: 05 декабря 2022г.

Дата проверки: 03 ноября 2022г.

Выглядеть молодо можно в любом возрасте! И не благодаря удачному макияжу, стильной прическе или модной одежде! А из-за поддержания на молодом уровне собственных ресурсов организма. Процесс старения организма сегодня можно контролировать и даже останавливать!

Это уже не фантастика, а реальность!

Как стареет кожа человека

Старение кожи, как и организма в целом, представляет собой сложный биологический процесс, в котором участвует множество факторов, включая генетические и факторы окружающей среды. При этом особую роль играет ультра-фиолетовое облучение. Выделяют два основных типа старения кожи: внутреннее (хронологическое) и внешнее (фотостарение). Каждый из них имеет свои клинико-морфологические особенности.

Стареющая с годами кожа, которую берегли от солнца, становится тоньше, бледнее, снижаются ее эластичность и упругость, появляются тонкие поверхностные морщины. Солнце действует по-другому: кожа утолщается, грубеет, становится более сухой, в ней формируются глубокие морщины и отдельные участки с темной пигментацией — так называемым солнечным лентиго.

Фотостарение может произойти гораздо раньше хронологического — не зря в XIX веке дамы тщательно прятали лица от солнца под шляпами и зонтиками. И если хронологическое старение, увы, неизбежно, то фотостарение напрямую зависит от времени, проведенного на солнце и в соляриях, а также от генетически предопределенной степени пигментации кожи. Особенно страдают открытые участки (лицо, шея, руки), поскольку внешние факторы накладываются на хронологический процесс и ускоряют его. Особенно не везет людям, живущим в жарких странах. Кожа у них, как правило, грубая. И признаки старения проявляются раньше, чем у людей, живущих в умеренном климате.

В процессе старения происходит уменьшение содержания в коже коллагена — основного структурного компонента. Перемены происходят разительные: у пожилых людей (80 лет и старше) коллагена не только вырабатывается примерно на 75% меньше, чем у молодых (18—29 лет), но и уровень его деградации повышается на 75%. Параллельно снижается количество коллагенов I и III типов. Это одни из основных типов коллагена кожи.

Любителям позагорать стоит помнить: однократное воздействие УФ-лучей на кожу в средних дозах (до ее легкого покраснения) снижает продукцию коллагена на 80%, причем вернется она к норме только через два-три дня. Если же подставлять кожу солнцу регулярно, то продукция коллагена подавляется очень надолго и со временем изменения могут стать необратимыми.

Авдеюк Елена Владимировна

Врач-дерматовенеролог, косметолог

Коллагена с годами и под действием солнца не только становится меньше, но и изменяются его структура и организация. Из-за этого нарушается опорный каркас кожи и образуются морщины. Надо сказать, что на участках кожи, которые подвергались длительному УФ-воздействию, развиваются еще и специфические изменения, связанные с нарушением образования эластиновых волокон (так называемый эластоз).

Коллаген вырабатывают клетки фибробласты, а значит, именно они ответственны за те фундаментальные процессы, которые нас так огорчают. Фибробластов с возрастом становится меньше примерно на 35%, но вопрос не только в их количестве. Изменяется также морфология фибробластов, способность делиться, большинство их хуже выполняют свои производительные функции.

В результате нарушается баланс между синтезом и деградацией межклеточного матрикса, понижается содержание коллагена. Кожа становится тоньше, снижается ее гидратация и упругость, образуются морщины.

Стимулировать фибробласты дермы к активной работе и восполнению утраченного объема межклеточного матрикса можно различными способами. В эстетической медицине сегодня активно применяются для этого различные инъекционные и аппаратные методики. Например, делаются внутрикожные инъекции различных препаратов, родственных по биохимическому составу межклеточному веществу (это может быть, например, гиалуроновая кислота). Воздействуют на кожу лазером — при этом происходит дозированное микроповреждение слоев дермы, которое активирует регенерацию. При-меняют также радиоволновую терапию, дермабразию и другие методы, которые заставляют фибробласты взяться за работу и снова начать синтезировать молодой коллаген.

Что такое SPRS-терапия?

Принципиально иной подход использует регенеративная медицина. Она предполагает привнесение в ткани препарата, который сам восстанавливает эти ткани, или запускает в них собственные физиологические механизмы и регенерацию, или делает то и другое сразу.

Уже существуют эффективные биотехнологические подходы. Например, для восстановления кожи при различных язвах успешно используют препарат Apligraf (США) — искусственно выращенный в специальной среде эквивалент кожи. В его состав входят аллогенные кератиноциты (аллогенные — значит донорские; кератиноциты составляют основную массу эпидермиса -верхнего слоя кожи) и дермальные фибробласты. Эффективность препарата проверена более чем в 250 тысячах клинических наблюдений.

Другой американский препарат Dermagraft содержит только аллогенные дермальные фибробласты (более 50 тысяч наблюдений). А в комплексном лечении тяжелых ожогов хорошо себя проявил препарат Epicel с собственными кератиноцитами пациента (США, примерно 2 тысячи наблюдений).

В 1994 году американская компания Isolаgen (сейчас она называется Fibrocell Science) впервые предложила новый способ коррекции морщин — введение в кожу пациента аутологичных, то есть его собственных, фибробластов. Оказалось, что взятые у пациента и размноженные клетки дермы активно синтезируют коллаген и другие компоненты межклеточного матрикса. Но главное — после трансплантации в дерму их синтетическая активность сохраняется.

В 1999 году Isolаgen опубликовала результаты масштабного клинического исследования, проведенного в 1995—1999 годах. В нем участвовали 1450 пациентов с выраженными морщинами на лице. Было показано, что метод безопасен (срок наблюдений 48 месяцев) и эффективен. Позже, в 2003—2008 годах, компания провела другие клинические исследования с участием более 800 пациентов. Двенадцать месяцев наблюдений снова подтвердили безопасность технологии и то, что морщины действительно уменьшаются почти наполовину. При этом эффект сохраняется очень долго.

Ученые российского Института стволовых клеток человека начали заниматься данной проблемой в 2003 году. В итоге была создана российская технология (ее официальное название — SPRS-терапия), сходная с американской, но имеющая ряд существенных отличий. Официально она разрешена к применению для коррекции возрастных и рубцовых изменений кожи в клиниках России с июля 2010 года. Год спустя компания Fibrocell Science также получила одобрение американского Агентства по контролю качества пищи и лекарственных препаратов (FDA) на использование аналогичной технологии для коррекции морщин в области носогубных складок. В целом почти за двадцать лет и российские, и американские ученые провели немало клинических исследований, которые подтвердили, что метод действительно дает очень хорошие результаты — им довольны все пациенты и врачи.

Как проводится SPRS-терапия?

У пациента из-за уха (там кожа меньше всего повреждается УФ-лучами) берут кусочек кожи диаметром 4 мм и из него получают культуру фибробластов.

Затем в лабораторных условиях класса GMP (Good Manufacturing Practice – надлежащая производственная практика) получают клеточный препарат (SPRS-препарат), содержащий культивированные фибробласты. В ходе клеточного процессинга происходят отбор и стимуляция только молодых функционально активных фибробластов, сохранивших высокую способность к делению и синтезу важных для кожи компонентов.

Все процедуры проводят согласно разрешенной к применению Росздравнадзором РФ медицинской технологии «Забор, транспортировка, выделение, культивирование, криоконсервирование, хранение и использование аутологичных фибробластов для коррекции возрастных и рубцовых дефектов кожи» (разрешение ФС № 2009/398).

SPRS-препарат при строго контролируемых условиях (в термоконтейнере, постоянно поддерживающем температуру +4–8° С) доставляют в клинику, где пациенту проводят курс терапии, состоящий из двух процедур с интервалом в месяц.

Клеточный материал вводят по специальной методике: интрадермально – в папиллярный слой дермы, туннельным способом с помощью игл для мезотерапии (30G, 13 мм). Такой метод инъецирования позволяет равномерно и с адекватной плотностью ввести препарат во всей области, требующей коррекции, и пополнить пул резидентных фибробластов кожи пациента функционально активными клетками.

За час до проведения процедуры на кожу наносят анестезирующий крем ЭМЛА, что делает введение препарата безболезненным.

Материалы и методы

Первичную культуру дермальных фибробластов получали из биоптатов кожи посредством механической дезагрегации и последующей ферментативной обработки. Для этого биоптат промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим антибиотик (гентомицин) и обрабатывали раствором трипсина. Затем пипетировали, в результате чего освобождали клетки от матрикса, центрифугировали, отмывали от раствора трипсина и ресуспендировали в культуральной среде DMEM/F12, содержащей 10 % сыворотки. Высевали на чашки Петри в плотности 1 × 105 – 2 × 105 клеток/см2 и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 4-го пассажа, охарактеризовывали по экспрессии характерных маркеров и криоконсервировали, создавая банк первичной культуры дермальных фибробластов человека, на которой проводили все дальнейшие исследования. Использование в исследовании одной и той же первичной культуры клеток позволяет сопоставлять и сравнивать полученные данные.

Для получения «стареющей» культуры клетки из полученного ранее банка размораживали методом быстрого оттаивания при +37 0С, отмывали от остатков сыворотки и ДМСО раствором Хенкса с помощью центрифугирования в течение 7 мин. при 1000 g. Супернатант удаляли, полученный осадок из клеток ресуспендировали в полной ростовой среде, высевали на чашки Петри и помещали в стандартные условия инкубирования (+ 37 0С, 5 % СО2). Культивировали до 18-го пассажа, когда становились хорошо заметны все признаки репликативного старения дермальных фибробластов. Размороженная, не пассированная культура клеток 4-го пассажа (Р4) считалась контрольной и соответствовала по своим характеристикам фибробластам молодой кожи.

Для исследования дозозависимости препарата Meso-Wharton P199™ на 2D-культуре аликвоты (500 мкл) пептида P199, растворенного в солевом буфере, смешивали с полной ростовой средой в соотношении 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000. Анализ цитотоксичности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов 18-го пассажа (Р18). Клетки помещали на 12-луночные планшеты в плотности 10 000 клеток на лунку. В качестве контроля исследовали поведение клеток в полной ростовой среде без добавления пептида. Клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее окрашивали растворами Hoechst 33258 (0,004 мг/мл) и йодида пропидия PI (0,001 мг/мл), с помощью которого оценивали жизнеспособность клеток по проникновению в их ядро PI под инвертированным флуоресцентным микроскопом Olympus CKX41 (Olympus, Япония).

Анализ биоактивности проводили на 2D-культуре дермальных фибробластов и помещали на покровные стекла в чашки Петри (35 мм). Исследовали морфологию клеток и экспрессию характерных для фибробластов маркеров: цитокератина 19, эластина, α-гладкомышечного актина (αSMA), PCNA (маркера пролиферации), коллагенов I, III и IV типов. В качестве контроля культивировали клетки 18-го пассажа в полной ростовой среде без добавления препарата. Для проведения иммуноцитохимического анализа клетки культивировали в присутствии пептида в течение 72 ч., далее фиксировали в 4 % растворе параформальдегида (4 0С, 20 мин.). Затем стекла инкубировали с первичными антителами к цитокератину 19, эластину, α-гладкомышечному актину (αSMA), PCNA (маркеру пролиферации), коллагенам I, III и IV. Результат визуализировали с помощью вторичных антител, конъюгированных с флуорохромами FITC (E=525 nm) и DyLight594 (E=617 nm). Ядра докрашивали раствором Hoechst 33258 (0,004 мг/мл). Анализ проводили с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus Fluoview FV10 (Olympus, Япония).

Для изучения влияния препарата Meso-Wharton P199™ на образование сфероидов из дермальных фибробластов исследовали монослойные клеточные культуры фибробластов Р18, которые культивировали с добавлением в ростовую среду препарата Meso–Wharton P199™ и культуры фибробластов Р18, культивируемые без добавления препарата Meso-Wharton P199™. Для данного этапа исследования использовали аликвоты (500 мкл) пептида р199, растворенного в солевом буфере, и смешаные с полной ростовой средой в соотношении 1:10. Фибробласты культивировали в течение 72 ч., отмывали от ростовой среды раствором Версена, затем обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и снимали с чашек. Подсчитывали количество клеток в суспензии и центрифугировали. Осадок ресуспендировали в полной ростовой среде и помещали на агарозные планшеты в концентрации 1 × 103 клеток в лунку. Агарозные планшеты помещали в 12-луночные культуральные планшеты и вели прижизненное наблюдение в стандартных условиях камеры прибора Cell-IQ (СМ Technologies, Финляндия) в течение семи дней. Фоторегистрацию осуществляли каждые 20 мин. с помощью программы Cell-IQ Imagen, обработку изображений проводили в программном пакете Cell-IQ Analyzer. Положительным контролем считали формирование сфероидов из фибробластов 4-го пассажа (Р4) в полной ростовой среде без добавления пептида.

Когда появится результат после проведения SPRS-терапии?

Результат виден через 10—14 дней после окончания процедур: кожа становится более упругой, эластичной, улучшаются цвет и контуры лица, уменьшаются количество и глубина морщин, а также выраженность пигментных пятен.

Еще один важный показатель — увеличивается толщина кожи (через год в среднем на 65%). Через месяц на «хорошо» и «отлично» эффект оценивают 88% пациентов, через 3, 6, 12 и 24 месяцев — 100% пациентов. Морщины уменьшаются через месяц на 14%, а через 12 месяцев — на 46 % по сравнению с исходным состоянием.

Более трети пациентов, которым была проведена коррекция одной области, обратились повторно за терапией других областей – шеи, зоны декольте, рук.

Эффект сохраняется как минимум два года и нарастает во времени.

Необходимое количество введений препарата

Самое главное в процедуре – индивидуальный подход к каждому пациенту. Чаще всего курс включает 1-3-5-7-10 введений фибропластов. Количество раз зависит от количества вводимого препарата. Однако, независимо от количества введений, образец ткани нужно брать один лишь раз, так как культуры клеток сохраняются криогенным путём для последующего лечения.

Если у вас возникли вопросы по применению препарата ФИБРОБЛАСТЫ или вы хотите записаться на консультацию, звоните по телефону или.

Банк собственных фибробластов пациента

Следует отметить, что медицинская технология по применению аутологичных фибробластов обладает еще одной особенностью – она позволяет банкировать фибробласты кожи пациента. Их можно в любое время разморозить и использовать как для коррекции возрастных изменений кожи, так и в случае непредвиденной ситуации – при ожогах и других повреждениях, требующих незамедлительного применения фибробластов для восстановления целостности кожного покрова. Такое банкирование аутологичных фибробластов кожи представляет собой своеобразную «систему биологического страхования».

О том, как часто можно прибегать к повторной коррекции кожи синтезированными фибробластами, врачу-косметологу напомнит «Паспорт кожи» пациента, составленный в процессе забора и культивирования кожных клеток

Всего 3 визита в клинику!

1-ый ВИЗИТ

• Консультация, сбор анамнеза, определение области терапии;
• Забор биоптата;
• Забор сыворотки;
• Создание банка собственных фибробластов кожи;
• Создание паспорта кожи;
• Хранение аутофибробластов в течение 12 мес.

2-ой ВИЗИТ

• Введение первой дозы SPRS-препарата;
• Назначение даты введения 2-ой дозы препарата (через 30-45 дней);
• Рекомендации по реабилитации после процедуры;
• Интерпретация данных Паспорта кожи.

3-ий ВИЗИТ

• Введение второй дозы SPRS-препарата;
• Рекомендации по реабилитации после процедуры